安全操作液氮罐規范及其不同樣品凍存方法

　　液氮罐在生物樣品存儲中廣泛應用，因其能夠提供極低的溫度環境，從而實現樣品的長期保存。為了確保操作安全及樣品的有效冷凍保存，正確使用液氮罐至關重要。液氮罐通常用于保存細胞、組織、DNA、RNA等生物樣品，操作不當不僅可能導致樣品損失，還可能造成安全隱患。液氮的溫度低至-196℃，對人體和物品都有極大危害，因此在操作時需要特別小心。

　　液氮罐操作規范

　　液氮罐在使用過程中必須遵守嚴格的安全操作規范。液氮為無色、無味、無臭的液體氣體，具有極低的溫度和高揮發性，存放和運輸時需要采取適當措施，避免對人員和環境造成傷害。

　　1. 穿戴防護裝備

　　操作液氮罐時，工作人員應穿戴專用的防護裝備，包括防護眼鏡、面罩、耐低溫手套和穿著長袖、長褲等防護衣物，以防止液氮濺出導致凍傷。

　　2. 選擇合適的操作環境

　　液氮罐應放置在通風良好的環境中，避免密閉空間內操作，防止液氮蒸發后氣體濃度過高，造成缺氧或窒息等危險。應避免靠近火源、高溫物體或明火設備，因為液氮的蒸發可能引起爆炸。

　　3. 使用時注意壓力管理

　　液氮罐在使用過程中會不斷蒸發產生氣體，因此必須定期檢查罐體的壓力是否正常。對于長期保存樣品的液氮罐，應保持液氮液面在適當的高度，過低可能導致樣品無法保持低溫狀態。

　　4. 清潔和維護

　　定期對液氮罐進行清潔和維護，檢查罐體的外部和內部是否有裂紋、損壞或腐蝕現象。清潔時，使用干凈的無纖維脫落的布料，避免污染樣品。

　　5. 液氮的注入

　　液氮應通過專業的注入裝置加注到液氮罐中，操作時應避免直接接觸液氮，并確保注入口與罐體的密封良好，以防氣體泄漏。

　　樣品凍存方法

　　液氮罐主要用于生物樣品的凍存。凍存過程中的操作規范直接影響樣品的存活率和后續的復蘇效果。不同種類的生物樣品具有不同的凍存要求，以下是幾種常見樣品的凍存方法。

　　1. 細胞凍存

　　細胞的凍存是最常見的液氮罐應用之一。凍存前需要對細胞進行處理，以減少細胞在冷凍和復蘇過程中的損傷。凍存步驟如下：

　　- 細胞收獲：將細胞培養液離心，去除培養基，獲取細胞沉淀。

　　- 細胞重懸：使用含有保護劑(如DMSO、甘油)的凍存液重懸細胞。DMSO一般濃度為10%，能夠有效防止細胞在冷凍過程中由于冰晶形成導致的損傷。

　　- 分裝樣品：將細胞懸液分裝到凍存管中，每個凍存管的體積不宜超過1mL，以便均勻冷凍。

　　- 逐步降溫：將凍存管放入-80℃的冷凍箱中逐漸降溫至-80℃，然后再轉移到液氮罐中進行長期保存。

　　- 凍存后檢測：凍存后的細胞在復蘇后要通過活性染色、細胞計數等方法檢測細胞的存活率和活性。

　　2. 組織樣本凍存

　　組織樣本的凍存需要特別注意保護結構和功能。凍存方法與細胞類似，但通常需要加入更多的保護劑，如甘油、二甲基亞硫酰胺(DMSO)等。

　　- 組織取樣與處理：通過外科手術取出所需組織，進行適當的切割處理，確保每塊組織的大小適中，以便更好地滲透保護劑。

　　- 加入保護劑：將組織放入冷凍保護液中，常用的凍存液包括含有10%-20% DMSO和10%-20%甘油的溶液。確保樣品充分浸泡。

　　- 降溫過程：將處理過的組織逐步降溫到-80℃，然后轉入液氮罐中。

　　3. DNA/RNA凍存

　　DNA和RNA樣品保存時需要避免降解。凍存時，建議使用緩沖液保護其完整性，常用的凍存液包括TE緩沖液或含有RNA保護劑的溶液。

　　- 樣品處理：提取純化DNA/RNA后，加入適當濃度的保護液。

　　- 凍存步驟：將含有DNA/RNA的樣品分裝在凍存管中，確保每個凍存管的體積不超過200μL。

　　- 保存與復蘇：凍存時應確保凍存管密封良好，避免泄漏。復蘇時，需迅速取出樣品，并立即在冰上解凍。

　　4. 血液樣品凍存

　　血液樣品中含有豐富的血細胞和血漿蛋白，其凍存需要特殊處理以保證細胞和分子結構的完整性。

　　- 血液分離：通過離心分離血漿和血細胞，通常使用低速離心(約1500g)，分離后的血漿可用于凍存。

　　- 加入保護劑：血液樣品中常用的凍存保護劑為10% DMSO。對于血液細胞凍存，建議使用紅細胞保護劑。

　　- 分裝與冷凍：血液分裝至凍存管中，快速降溫至-80℃，再轉入液氮罐中進行長期保存。

　　液氮罐的正確使用與樣品凍存方法的嚴格執行是確保生物樣品長期保存和復蘇成功的關鍵。在操作過程中，每一個環節都不能忽視，確保液氮的穩定供應和樣品的完整性。