1.研究對象及分組：選取2010年1月至2014年9月在生殖中心因男方梗阻性無精子癥行icsi助孕者，共214個周期，其中采用冷凍復(fù)蘇睪丸精子行icsi助孕107個周期(凍精復(fù)蘇組)，采用新鮮睪丸精子行icsi助孕107個周期(新鮮精子組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：第1周期行icsi治療、長方案超排卵、夫婦雙方染色體核型分析均正常者。排除標(biāo)準(zhǔn)：女方子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、子宮畸形、卵巢功能衰竭等。梗阻性無精子癥確診依據(jù)：至少3次射出精液離心沉淀后未見精子，診斷性睪丸活檢可見成熟精子。
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2.睪丸穿刺取精：常規(guī)消毒鋪巾，利多卡因局部麻醉，用帶側(cè)孔的睪丸穿刺針經(jīng)皮睪丸穿刺，稍拔出針芯，擠壓睪丸，再插入針芯，然后連穿刺針一起拔出，從穿刺針側(cè)孔挑出睪丸組織，置于含10%人血清白蛋白的人輸卵管培養(yǎng)液中，用2只1ml注射器針頭劃破曲細精管，倒置顯微鏡下觀察，吹打混勻后直接離心處理。
3.精子冷凍：精子冷凍保護劑置室溫平衡30min;將經(jīng)處理后含有精子的懸液與精子冷凍保護劑以1：1比例混勻，移入精子保存管進行分裝，室溫平衡10min;懸吊于液氮罐內(nèi)距液氮面5cm，10min后將精子保存管放入液氮長期保存。
4.精子復(fù)蘇：從液氮中取出保存精液的冷凍管，在室溫中放置30min;加入等量含10%sss的HtF培養(yǎng)液，混勻后進行洗滌離心;最后在沉淀物中加入含10%sss的HtF培養(yǎng)液混勻待用。
5.卵母細胞獲取、icsi及胚胎移植：超促排卵均采用黃體中期啟動的長方案，當(dāng)直徑≥20mm的卵泡≥2個時，注射HcG10000U，36H后行陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵術(shù)。取卵后4～6H選取成熟卵母細胞(mii期)行icsi操作。取卵后第3天選擇最優(yōu)的1～3枚胚胎移植。
6.判斷指標(biāo)：正常受精：icsi后16～17H觀察受精情況，以雙原核為正常受精;卵裂率：icsi后40～41H觀察卵裂情況，并計算卵裂球比例;優(yōu)質(zhì)胚胎：以卵裂球大小均勻，細胞飽滿，碎片<5%的i級胚胎和碎片≤20%的Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎;可利用胚胎：所有移植及冷凍的胚胎;臨床妊娠：移植后14D查血β-HcG，確定是否生化妊娠，若為陽性，2周后B超檢查提示宮腔內(nèi)或?qū)m外見孕囊及胎心搏動者為臨床妊娠。
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7.統(tǒng)計學(xué)分析：采用sPss13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珚x±s)表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
