1材料與方法
1.1實驗材料利用新疆伊犁河恰甫其海水庫養(yǎng)殖的哲羅鮭(Huchotaimen)親魚21多尾，培育在(3×20)m2的長方形流水養(yǎng)魚池中，進排水量約(15~20)m3/h，在水溫達到8℃時對雄魚注射促黃體生成素釋放激素類似物(LRH-A2)2.5µg/kg和絨毛膜促性腺激素(hu-manchorionicgonadotropin,HCG)400IU/kg催熟，雄魚成熟后采用擠壓腹部法收集精液，采精時避免光線直射，將精液直接收集在50mL玻璃瓶中，置于事先放入冰塊的保溫盒中，帶回實驗室進行冷凍保存實驗。
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1.2精子稀釋液的配制和篩選利用市售NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、Na2、HPO4、NaHCO3、NaH2PO4、KHCO3、KOH、MgSO4、KH2PO4、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、Tris、胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、N-二(羥乙基)甘氨酸(bicine)、蛋黃、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)配制了9種精子稀釋液和冷凍保存液：MPRS、RS、Hanks、ELS、EG1、EG2、Stein、SS-2、D15(表1)。分別利用以上精子稀釋液以1：1的比例稀釋精液，平衡5min后，利用OLYMPUS顯微鏡觀察并統(tǒng)計精子活力(運動精子/全部精子數(shù))。然后分別在以上稀釋液中加入20%的DMSO，再以1：1的比例稀釋精液，平衡5min后在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計精子活力。最后將稀釋后的精液分裝在2mL冷凍管中，每管注入稀釋精液1.0mL，采用三步法冷凍保存在液氮中。冷凍3~4h后，利用37℃水浴解凍精子，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計精子活力。
表1精子稀釋液配方
1.3抗凍劑(甲醇和二甲基亞砜)濃度的篩選以ELS為稀釋液，分別以終濃度為4%、6%、8%、10%和12%加入抗凍劑甲醇(methanol)和DMSO，稀釋精液在加入冰塊的保溫盒中平衡20min后在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計精子活力。然后將稀釋精液分裝在2mL冷凍管中，每管注入稀釋精液1.0mL，采用三步法冷凍保存在液氮罐中。冷凍3~4h后，利用37℃水浴解凍精子，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計精子活力。
1.4葡萄糖濃度的篩選以D15為基礎(chǔ)稀釋液，在其中分別加入15%、20%、25%、30%、35%和40%的葡萄糖，再加入終濃度6%甲醇，以1：1的比例稀釋精液，在加入冰塊的保溫盒中平衡20min后在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計精子活力。然后將稀釋精液分裝在2mL冷凍管中，每管注入稀釋精液1mL，采用三步法冷凍保存在液氮中。冷凍5h后，利用37℃水浴解凍精子，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計精子活力。
1.5哲羅鮭精子在不同稀釋液中短期冷藏保存分別以D15、D30、Stein和ELS為稀釋液，以1：1的比例稀釋哲羅鮭精液，分別注入2mL冷凍管中，每管注入1.5mL，同時以未加稀釋液的鮮精作對照，將冷凍管置于保溫盒中，保溫盒中事先放入體積1/3的冰塊，保存溫度2~4℃。每隔5h在顯微鏡下觀察統(tǒng)計一次精子活力，直至精子完全失活。
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1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析利用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-WayANOVA)，采用Student-Newman-Keuls進行多重比較和差異顯著性分析，篩選精子活力最高的精子稀釋液配方、抗凍劑成份和濃度。利用Excel軟件對統(tǒng)計結(jié)果做圖，在圖中利用a、b、c后d等字母表示分析結(jié)果之間的顯著性差異，字母相同為無顯著性差異(P>0.05)，字母不同具顯著性差異(P<0.05)。
